1. 海肾荧光素酶
萤火虫荧光素酶在氧气、ATP和镁离子同时存在的条件下,催化荧光素氧化,生成氧化荧光素,同时产生黄绿色光,波长540-600nm。
荧光素酶(luciferase)是自然界中能够产生生物荧光的酶的总称。荧光素酶可以催化荧光素氧化成氧化荧光素,在荧光素氧化的过程中,会发出生物荧光。然后可以通过荧光测定仪测定荧光素氧化过程中释放的生物荧光。荧光素和荧光素酶这一生物发光体系,可以极其灵敏、高效地检测基因的表达,是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法。
目前,最有代表性的是从甲虫中分离得到的萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase)和从海肾中分离得到的海肾荧光素酶(Renilla luciferase)。
2. 海肾荧光素酶基因
1 荧光酶是一种酶,能够将化学能转化为光能,产生荧光现象。2 荧光酶的原理是基于荧光共振能量转移(FRET)的技术,它可以将一种化学物质的能量转化为另一种化学物质的荧光信号,从而实现生物分子和细胞成像的目的。3 荧光酶广泛应用于生物学领域,例如基因工程、蛋白质表达、细胞成像等,是生物技术和医学研究中不可或缺的重要工具。
3. 海肾荧光素酶质粒
启动子的预测 转录因子的预测 报告基因质粒的构建 实验方法及结果分析 用生物信息学方法分析并预测启动子区可能的转录因子结合位点。
设计引物用PCR法从基因组DNA中克隆所需的靶启动子片段,将此片段插入到荧光素酶报告基因质粒(pGL3-basic)中。筛选阳性克隆,测序。扩增克隆并提纯质粒备用。扩增转录因子质粒,提纯备用。同时准备相应的空载质粒对照,提纯备用。培养293(或其它目的细胞),并接种于24孔板中,生长10-24小时(80%汇合度)。将报告基因质粒与转录因子表达质粒共转染细胞。提取蛋白并用于荧光素酶检测。加入底物,测定荧光素酶的活性。计算相对荧光强度,并与空载对照比较。4. 海肾荧光素酶报告基因
基因荧光检测是一种自然发光反应,通过荧光素酶与 ATP进行反应,可检测人体细胞、细菌、霉菌、食物残渣,在15秒钟内得到反应结果。
荧光检测的主要缺点在于只有少数化合物产生荧光。大多数的分子不发荧光,但含有可衍生的官能团用于合成能发荧光的衍生物。
5. 海肾荧光素酶载体
pGRE-luc(报告基因质粒)是用于检测糖皮质激素响应元件(glucocorticoid response element, GRE)转录激
活水平的报告基因质粒。pGRE-luc是以pGL6质粒为模板,在其多克隆位点插入了多个GRE位点,可以高灵敏度
地检测GRE的激活水平,检测糖皮质激素介导的信号途径(glucocorticoid-mediated signaling pathway)的激活水平。
? pGL6质粒是用于在哺乳动物细胞中进行萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)报告基因检测的新一代质粒。该报告基因质粒比
Promega公司的pGL3系列有了全面的改进,一方面对于luciferase的编码进行了改进,确保能更好地在哺乳动物细胞中进行
表达,同时对整个质粒中所有可以被预测出的可能的转录因子结合位点全部进行了适当的突变处理,在保持原有功能不
变的情况下,使各种转录因子在质粒上的非特异性结合降到最低